1、SPR可用于哪些生物分子的实验?
蛋白质,小分子,DNA\RNA,脂类\脂质体\生物膜,多糖,多肽,全细胞,病毒,微生物。
2、SPR对于样品及配体有什么要求?
样品需要新鲜、有活性,要用0.22μm膜过滤或离心,配体的浓度要达到90%以上,分析物溶液中一般不能含有甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质。
3、配体和分析物的浓度如何准备?
一般的建议是,配体蛋白的准备量在1 mg/mL浓度、50 μL以上(实际工作浓度约50 μg/mL),具体配体偶联量参见下方公式描述。
分析物浓度范围的确定与结合反应的解离平衡常数(KD)有关:在动力学分析中,一个理想的分析物浓度范围可以从10 × KD作为最高浓度进行梯度稀释;在亲和力分析中,理想的分析物浓度范围可以选择从2 × KD的浓度作为最高浓度进行梯度稀释。
如果分析物是小分子,蛋白与小分子结合反应的KD值,基本都在μM级别,因此可以将小分子最高浓度设为1000 μM,按照3倍甚至5倍的稀释比例来配制浓度梯度(拉大范围)。
4、SPR可以提供哪些信息?
1)有无结合
2)结合的特异性和选择性
3)两种分子的结合强度--亲和力
4)结合和解离的快慢和复合体的稳定性--动力学
5)功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序
6)分子结合的温度与热力学特征
7)目标分子活性含量的检测
5、仪器预约及使用须知:
仪器编号:Biacore 8K plus(A23000124)、Biacore S200(18002781)
放置地点:医学科学楼F017
特别提醒:第一次使用前需要先申请上机资格并电话沟通实验需求,参加平台组织的集体培训或准备预实验样品预约工作日时间进行一对一实验辅助及操作培训。
6、实验前需要准备些什么?
待检测的样品(未稀释的母液),芯片(可以自带、也可以提前咨询平台),移液枪和枪头,缓冲液瓶(500\250ml),EP管及其他所需试剂耗材。
*芯片的选择:
1)CM5芯片→蛋白(PI>4)、肽段、小分子化合物
2)CM7芯片→小分子化合物
3)SA芯片→生物素标记的分子,如核酸、糖类等
4)Biotin CAP芯片→可逆性生物素捕获芯片
5)ProteinA,G,L芯片→抗体
6)NTA芯片→His重组蛋白
7)L1芯片→模拟脂质双分子层环境
8)HPA芯片→实现膜系统相关的互作分析
7、平台可以提供什么试剂?
氨基偶联试剂盒,缓冲液(10X HBS-EP、10X PBSP),50mM NaOH溶液,10mM醋酸钠缓冲液(Acetate4.0\4.5\5.0\5.5)以及再生试剂(Glycine1.5\2.0\2.5\3.0)。
8、Biacore S200仪器两边瓶子里装的都是什么液体?
左边:缓冲液,实验前需要换上新鲜配制的实验所需的缓冲液。进液管 A需要插入至缓冲液瓶底部。
右边:小瓶内为去离子水,大瓶废液瓶。使用前后均需要检查两个瓶子的情况,小瓶内需要添加500ml去离子水用于清洗进样针,废液务必及时倒至实验室指定的废液桶内。
9、芯片是否可以重复使用?
针对Biacore S200每张芯片有4个通道,一般会将1&2通道配套使用(1通道作为参比)、3&4通道配套使用(3通道作为参比),在非参比的通道上偶联配体进行检测;针对Biacore 8K每张芯片有8个通道,每个通道有一对Flow cell(共16个检测点),一般在每个通道的Fc2偶联配体,Fc1作为参比通道。实验后选择合适的再生条件对芯片进行再生,并且将使用完毕后的芯片浸泡在合适的缓冲液中保存,保证偶联的配体仍有活性的情况下,芯片可以多次使用。
10、SPR芯片的放置:
1)在控制软件内选择 Tools 菜单中的 Insert Chip 选项,打开芯片舱门,取出平台的维护芯片;
2)新使用的芯片选择New chip,选择芯片型号,Chip id填写芯片相关实验信息,Chip lot No.中可填写芯片批号(选填);已使用的芯片选择Reuse chip找到对应Chip id信息;
3)手持芯片,将有字的一面朝上,按照芯片上的箭头方向将芯片轻轻推入卡槽,最后合上芯片舱的舱门;
4)点击 Dock Chip 完成芯片置入,之后系统自动转入待机(Standby)状态;
5)选择 Tools→Prime选项,点击 Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统,为下一步的实验做好准备。
注意: ①实验结束后务必将自己的芯片取走并将平台的维护芯片重新放回;
②每次更换缓冲液或者芯片后,必须运行Prime程序。
11、SPR整个实验流程是什么?
配体偶联 → 表面测试 → 筛选再生条件 → 分析物进样 ( → 芯片再生 ) → 数据处理
12、配体的偶联量如何计算?
配体偶联是指将配体直接(将配体共价偶联与芯片表面、常用氨基偶联的方法)或者间接(捕获法,将捕获分子共价偶联于芯片表面,捕获分子在每个循环过程中通过亲合作用偶联配体)固定于芯片表面。
*根据以下公式计算目标偶联量:
Rmax 为芯片表面最大结合容量,通常代入 100 RU;
analyte MW和ligand MW分别为分析物和配体的分子量;
RL 为配体偶联量,实验时实际偶联量为1.5倍的 RL;
Sm 为化学计量比,未知时选择 1 。
13、再生条件如何选择?
1)理想的再生条件:
将与配体结合的残留的分析物分子从芯片表面彻底除去的同时必须保持芯片上配体分子的活性;多次进样的结合水平都能基本维持稳定,和第一次进样相比结合水平的变化在10%之内。
2)常用的再生条件:
样品类型 | 推荐再生条件 |
抗体 | 10 mM glycine-HCl( pH 3-pH 1.5) |
非抗体类蛋白 | 10 mM glycine-HCl( pH 3-pH 1.5) |
MgCl2 (1-4 M) | |
NaOH(1-50 mM) | |
核酸 | 双链:1mM HCl 单链:1-50mM NaOH |
小分子 | 一般无需再生 |
脂单层 | 10-100mM NaOH或HCl |
脂双层 | 异丙醇:50mM NaOH(体积比2:3) |
NTA芯片 | EDTA |
注意:考虑再生试剂与运行缓冲液的兼容性。
14、分析小分子(DMSO为溶剂)时为什么需要做溶剂校正?如何做?
DMSO属于高折光率(refractive index)成分,含有DMSO的缓冲液流经活性通道时会存在一定的体积排阻效应,导致活性通道与参比通道上的信号存在差异。皆含有DMSO的缓冲液与分析物样品间的折光率误差往往难以避免。
一般对含有5% DMSO的样品以4.5% - 5.8%的范围进行溶剂校正,最终得到的溶剂校正曲线横坐标范围一般要落在-500 到 +1000 RU,校正曲线图谱中的两条竖线代表的是分析物中DMSO浓度范围,要求落在校正曲线的范围内,并且拟合的Chi²值小于2。
15、如何做好溶剂校正?
1)建议使用高品质的DMSO试剂,并且使用相同来源的DMSO溶解小分子和配制所需溶液。2)注意校正溶液的配制策略,例如只需配制含4.5%和5.8% DMSO的这两种缓冲液,中间梯度通过这两种溶液按照不同比例混合得到,而不需要一个个单独配制。3)由于DMSO具有吸潮的性质,在配制过程中应及时封闭,避免长时间敞口放置;在上机检测时,也应该对样品管进行密封。
16、蛋白的缓冲液中含甘油可以吗?
甘油自身折光率高,含量需在10%以下,尽可能地从母液中稀释较大倍数减少含量,作为固定相用来偶联在芯片时甘油不会产生影响,可以考虑调换偶联蛋白和分析蛋白的顺序,或者在尽可能降低甘油含量以及蛋白和蛋白的亲和力足够大的基础上忽略其影响
17、蛋白缓冲液含有0.1%BSA是否影响蛋白和蛋白的亲和力?
影响不大,在降低蛋白和蛋白结合过程的非特异吸附策略就包括额外添加少量的BSA减少和芯片的非特异吸附。实验结果也验证了是否含有这部分BSA,SPR测试得到的KD差别不大。
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18、小分子和蛋白的响应中呈向下的负值是怎么回事?
如果呈现负值,且成浓度梯度依赖趋势,以及响应值较大的话,可以继续做重复实验验证,向下的情况虽然不常见,但向上向下本质原因也只是因为折光率不同而已,仍然可以得到动力学和稳态学信息。如果出现负值,且响应值较小的话,很大原因是因为偶联的蛋白活性很低建议更换新鲜的、高纯度的蛋白重新偶联验证。
19、分析时应该选择哪种拟合模式?
关于拟合模式的选择,是选择动力学(Kinetics)分析还是亲和力(Affinity)分析,主要是根据响应值图谱的形状来判断的。对于动力学分析,要求响应值图谱在结合和解离阶段均展现出足够的曲率(“慢结合慢解离”),而亲和力分析则要求在每次的分析物进样阶段均达到稳态(steady state)。对于同时满足两种要求的响应值图谱,理论上两种分析模式均可以使用。
20、如何判断拟合结果的好坏?
1)拟合得出的KD值(即拟合曲线中竖线所在的横坐标值)应该尽可能落在分析物浓度范围之内,最好在最高浓度的一半以内。2)当拟合得到的实际Rmax值显著高于理论计算值时,说明结合反应未按照1:1的化学计量比进行,有可能出现了非特异性结合或者分析物分子的聚集。对于小分子样品来说,往往由于溶解度等问题发生聚集导致上述现象。而造成拟合得到的实际Rmax值低于理论计算值的原因,主要还是偶联的配体中有一定比例的分子未充分暴露结合活性。如果上述两种情况同时存在,此时仅通过Rmax值难以判断,需要通过其他实验结果来验证。3)offset代表的是零浓度时的响应值,这个值应该趋近于0;如果出现了异常高的值或者负值,需要检查参比通道和零浓度的响应值 。4)Chi²值反映了拟合结果与实验数据的接近程度,这个值越小,代表实验结果与拟合模型越接近。
21、如何解决非特异性吸附?
如果Binding to reference的值大于活性通道扣减参比通道(如Fc=2-1)后信号值的20%,则可以认为存在较显著的非特异性吸附。
非特异性吸附的来源是多样的,最常见的是分析物在参比通道芯片表面的吸附,其次可能来源于分析物中其他杂质成分在参比通道或者配体上的非特异性结合,甚至还可能是分析物在配体上的吸附(例如小分子在配体蛋白非活性位点的弱结合等)。
解决非特异性吸附可以:1)改变芯片表面或者分析物的性质。如互换配体与分析物的位置(不适用于小分子)、参比通道可以进行活化与封闭等。2)改变缓冲液条件抑制吸附的发生。非特异性吸附发生所依赖的作用力主要就是离子型相互作用或者疏水型相互作用,前者可以通过提高离子强度来抑制,而后者可以通过添加一定浓度的表面活性剂进行屏蔽。常规缓冲液中NaCl浓度在150 mM附近,可以考虑在原运行缓冲液中额外添加盐(至~300 mM甚至500 mM)。或在运行缓冲液中添加表面活性剂P20,工作浓度一般为0.05%。3)调整分析物的浓度范围。可以考虑调整分析物的浓度范围,将非特异性吸附的信号控制在相对不显著的范围之内进行实验。