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SPR常见问题 FAQ(持续更新中)
2021年08月31日    活性筛选平台     浏览:2713 次

1SPR可用于哪些生物分子的实验?

蛋白质,小分子,DNA\RNA,脂类\脂质体\生物膜,多糖,多肽,全细胞,病毒,微生物。

 

2SPR对于样品及配体有什么要求?

样品需要新鲜、有活性,要用0.22μm膜过滤或离心,配体的浓度要达到90%以上,分析物溶液中不能含有甘油、蔗糖、咪唑等高折光率物质。

 

3SPR可以提供哪些信息?

1)有无结合

2)结合的特异性和选择性

3)两种分子的结合强度--亲和力

4)结合和解离的快慢和复合体的稳定性--动力学

5)功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序

6)分子结合的温度与热力学特征

7)目标分子活性含量的检测

 

4、仪器预约及使用须知:

仪器编号:18002781

放置地点:医学科学楼F017

预约网址:http://yqgx.tsinghua.edu.cn/search/searchAction.do?ms=queryEquListAfterLogin&keyword=18002781

特别提醒:第一次使用前需要先申请上机资格并电话沟通实验需求,参加平台组织的集体培训或准备预实验样品预约工作日时间进行一对一实验辅助及操作培训。

 

5、实验前需要准备些什么?

待检测的样品(未稀释的母液),芯片(可以自带、也可以提前咨询平台),移液枪和枪头,缓冲液瓶(500\250ml),EP管及其他所需试剂耗材。

*芯片的选择:

1CM5芯片蛋白(PI>4)、肽段、小分子化合物

2CM7芯片小分子化合物

3SA芯片生物素标记的分子,如核酸、糖类等

4Biotin CAP芯片可逆性生物素捕获芯片

5ProteinAGL芯片抗体

6NTA芯片→His重组蛋白

7L1芯片模拟脂质双分子层环境

8HPA芯片实现膜系统相关的互作分析

 

6、平台可以提供什么试剂?

氨基偶联试剂盒,缓冲液(10X HBS-EP),50mM NaOH溶液,10mM醋酸钠缓冲液(Acetate4.0\4.5\5.0\5.5)以及再生试剂(Glycine1.5\2.0\2.5\3.0)。

 

7SPR仪器两边瓶子里装的都是什么液体?

左边:缓冲液,实验前需要换上新鲜配制的实验所需的缓冲液。进液管 A需要插入至缓冲液瓶底部。

右边:小瓶内为去离子水,大瓶废液瓶。使用前后均需要检查两个瓶子的情况,小瓶内需要添加500ml去离子水用于清洗进样针,废液务必及时倒至实验室指定的废液桶内。

 

8、芯片是否可以重复使用?

每张芯片有4个通道,一般会将1&2通道配套使用(1通道作为参比)、3&4通道配套使用(3通道作为参比),在非参比的通道上偶联配体进行检测。实验后选择合适的再生条件对芯片进行再生,并且将使用完毕后的芯片浸泡在合适的缓冲液中保存,保证偶联的配体仍有活性的情况下,芯片可以多次使用。

 

9SPR芯片的放置:

1)在控制软件内选择 Tools 菜单中的 Insert Chip 选项,打开芯片舱门,取出平台的维护芯片;

2)新使用的芯片选择New chip,选择芯片型号,Chip id填写芯片相关实验信息,Chip lot No.中可填写芯片批号(选填);已使用的芯片选择Reuse chip找到对应Chip id信息;

3)手持芯片,将有字的一面朝上,按照芯片上的箭头方向将芯片轻轻推入卡槽,最后合上芯片舱的舱门;

4)点击 Dock Chip 完成芯片置入,之后系统自动转入待机(Standby)状态;

5)选择 ToolsPrime选项,点击 Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统,为下一步的实验做好准备。

注意:   ①实验结束后务必将自己的芯片取走并将平台的维护芯片重新放回

            ②每次更换缓冲液或者芯片后,必须运行Prime程序。

 

10SPR整个实验流程是什么?

配体偶联  表面测试  筛选再生条件  分析物进样 (  芯片再生 )  数据处理

 

11、配体的偶联量如何计算?

配体偶联是指将配体直接(将配体共价偶联与芯片表面、常用氨基偶联的方法)或者间接(捕获法,将捕获分子共价偶联于芯片表面,捕获分子在每个循环过程中通过亲合作用偶联配体)固定于芯片表面。

*根据以下公式计算目标偶联量:

image.png

Rmax 为芯片表面最大结合容量,通常代入 100 RU

analyte MWligand MW分别为分析物和配体的分子量;

R为配体偶联量,实验时实际偶联量为1.5 RL

Sm 为化学计量比,未知时选择 

 

12、再生条件如何选择?

1)理想的再生条件:

将与配体结合的残留的分析物分子从芯片表面彻底除去的同时必须保持芯片上配体分子的活性;多次进样的结合水平都能基本维持稳定,和第一次进样相比结合水平的变化在10%之内。

2)常用的再生条件:

样品类型

推荐再生条件

抗体

10 mM   glycine-HCl( pH 3-pH 1.5)

非抗体类蛋白

10 mM   glycine-HCl( pH 3-pH 1.5)

MgCl2   (1-4 M)

NaOH(1-50   mM)

核酸

双链:1mM HCl 单链:1-50mM NaOH

小分子

一般无需再生

脂单层

10-100mM   NaOHHCl

脂双层

异丙醇:50mM NaOH(体积比2:3)

NTA芯片

EDTA


注意:考虑再生试剂与运行缓冲液的兼容性。