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ITC常见问题 FAQ(持续更新中)
2021年07月19日    药学技术中心     浏览:2425 次

ITC常见问题FAQ

(持续更新中)

准备阶段

一、在事先不知道结合比、结合常数等参数的情况下,应该如何准备滴定液和池液?

1.     若无更多信息,一般用200μM的滴定液滴定20μM的池液。在所有的滴定中,无论浓度如何,滴定液与池液的体积是固定的60μL与300μL。

二、在对解离常数有预期的情况下,应该如何设置滴定液和池液的浓度?

1.     按公式C=[Protein]/KD计算C值。

2.     根据以下表格选择池液蛋白与配体的浓度。

Estimated KD

μM

[Protein]

μM

[Ligand]

μM

C=[Protein]/KD

<0.5

10

100

>20

0.5-2

20

200

10-40

2-10

50

500

5-25

10-100

30

40* KD

0.3-3

>100

30

20* KD

<0.3

 

三、ITC样品准备的注意事项?

1.     池液和滴定液除了目标分析物外其余成分应保持完全一致。以蛋白和小分子为例,他们的buffer应该完全一样,且如果小分子溶液中含有少量DMSO等助溶剂,也应当在蛋白溶液中补加。

2.     不能使用易发生氧化还原反应的试剂。因为反应伴随的热量变化会严重影响结合热的检测。

3.     避免使用强酸强碱。强酸强碱会腐蚀仪器。

4.     避免使用高浓度有机溶剂。高浓度有机溶剂会腐蚀仪器,同时由于有机溶剂粘稠度增加会使滴定不准。

5.     测试前样品温度需与测试温度保持一致,或恢复到常温。

四、前往筛选平台进行ITC实验需要准备哪些实验用具?

1.     中小体积移液枪和枪头

2.     1.5mL EP管若干

3.     适量缓冲液

实验阶段

一、自动清洗时弹出窗口报错:不能检测到flow

1.     原因分析:连接问题导致洗液循环无法形成。

2.     解决方案:

a)     程序中设置单独清洗样品池与滴定针。

b)    检查各试剂瓶内试剂是否在半满以上,瓶盖是否拧紧。

c)     如果设置了样品池清洗,检查样品池清洗泵是否插入样品池,插入后稍用力向下按可以听 到“哒”的锁定声。

d)    检查滴定针橡胶管末端的黑色橡胶头是否完好。

e)     检查橡胶管是否与滴定针正常连接,是否完全插入,重新插拔橡胶管。

f)      检查滴定针下方的固定螺帽是否拧紧。

g)    检查滴定针是否正确插入清洗位,并且被清洗位的卡扣锁定。

h)     都检查完无误后再次清洗,若仍然报错,一般都是橡胶管仍未完全连接,多次插拔滴定针橡胶管,多次重复尝试清洗。

i)      若以上方法都不起效,联系仪器管理员。

二、如何设置对照试验?

1.     一般用样品与缓冲液滴定作为对照。

2.     对照实验与主实验流程一致。

3.     在保存结果时,如果主实验结果文件命名为Result,必须将对照试验的结果文件命名为Result_ctrl


三、每根玻璃微量进样针都有自己的用途,切勿搞混以免影响实验结果。

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四、上样时样品池中无法加入280uL池液

1.     原因分析:样品池侧壁有气泡。

2.     解决方案

a)     上样时轻、缓,慢慢把池液注射入样品池。随着液体注入缓慢提升上样针。

b)    可以用上样针在样品池里沿一个方向轻轻搅动。注意搅动程度不能剧烈。

c)     若液面已经有大量气泡无法除尽,吸出池中液体重新上样。

数据分析阶段

一、判断信号大小的标准是什么?

1.     正常情况下,水与水的滴定信号值应该在0.03左右。

2.     若滴定曲线里最强信号值也仅有不到0.1,在对结合有信心的前提下,可考虑整体提高滴定液和池液的浓度再次尝试。

二、如何拷走数据?

            1.    通过桌面的清华网络客户端登录上校园网,在浏览器上登录邮箱。

            2.    禁止使用常用USB移动设备。

            3.    无法连接校园网的情况下,与仪器管理员联系,提供邮箱并由管理员代发。