ITC常见问题FAQ
准备阶段
一、在事先不知道结合比、结合常数等参数的情况下，应该如何准备滴定液和池液？
1. 若无有关亲和力的参考信息，一般可尝试用200 μM的滴定液滴定20 μM的池液。
单次滴定实验，滴定液与池液的体积按照60 μL与300 μL准备（滴定净体积为40 μL滴280 μL）。
二、在对解离常数有预期的情况下，应该如何设置滴定液和池液的浓度？
1. 按公式 C=[滴定池大分子浓度]/KD计算C值。
C值决定了ITC结合等温线的形状。数据分析的准确性和可靠性依赖S形等温线。
2. 根据以下表格选择池液蛋白与配体的浓度。
预估KD μM | [滴定池浓度] μM | [滴定物/配体浓度] μM | C=[滴定池浓度]/KD |
<0.5 | 10 | 100 | >20 |
0.5-2 | 20 | 200 | 10-40 |
2-10 | 50 | 500 | 5-25 |
10-100 | 30 | 40* KD | 0.3-3 |
>100 | 30 | 20* KD | <0.3 |
3. C值选择原则：
最优范围：10 < C < 100。此范围内可同时高精度地拟合KD, ΔH和n。
可接受范围：1 < C < 1000。
C < 1：结合等温线呈浅坡形，无拐点。KD与ΔH、n高度相关，拟合时必须固定其中一个参数。
C > 1000：结合等温线呈陡峭L形，只能准确测定ΔH和n，无法可靠测定KD，需采用竞争ITC。
三、ITC样品准备的注意事项
1. 保证蛋白活性，例如采用新鲜制备的样本。
2. 缓冲液匹配：池液和滴定液除了目标分析物外其余成分应保持完全一致。最好将大分子和配体均透析到同一缓冲液中。如果配体太小无法透析，则先透析大分子，然后用透析尾液溶解配体。
3. DMSO匹配：若使用DMSO，应确保蛋白溶液和配体溶液中的DMSO浓度一致，通常每相差0.5%就会产生明显的热效应。
4. 样本浓度误差是结合参数误差的主要来源，尤其影响化学计量比n。
蛋白质浓度：首选紫外吸光度法（A280），使用精确的摩尔消光系数（可通过在线工具（如ExPASy ProtParam）根据序列估算消光系数）。避免使用：Bradford等比色法，误差可高达50%。
配体浓度：对于小分子，精确称量是关键。
7. 测试前样品温度需与测试温度保持一致，或恢复到常温。
四、如何评估和保证样品质量？
1. 样品质量是获得可靠ITC数据的关键。建议使用多种技术验证样品状态，如：
质谱（ESI-MS）：检测蛋白纯度与降解；
动态光散射（DLS）：评估样品均一性与聚集状态；
差示扫描量热法（DSC）：评估蛋白热稳定性与DMSO耐受性。
2. ITC测得的化学计量比n值也可用于评估蛋白的结合活性。
若值显著低于1，可能提示样品存在非活性组分或聚集。
五、如何选择合适的缓冲液与添加剂？
1. 缓冲体系的pH范围一般为2-12（常用PBS）；使用高浓度配体时，如mM 级或以上，可能出现pH 不匹配，需酸碱滴定到要求的pH。
2. 还原剂避免使用DTT（不稳定且易氧化产热），推荐使用β-巯基乙醇或TCEP。
3. 去垢剂浓度需低于其临界胶束浓度（CMC），除非研究对象为胶束本身。
4. 高粘度添加剂（如甘油）应控制在最低浓度。
5. 缓冲液pKa应在实验pH值的1个单位以内。
6. 避免使用具有多个相近pKa的多元酸缓冲液（如柠檬酸盐），因其贡献难以分离。
7. 确保缓冲液不与相互作用分子发生特异性结合（质子耦合效应）。
8. 如果结合过程涉及质子的吸收或释放（即质子化状态改变），缓冲液的电离焓（ΔHB, ion）将贡献到观测到的表观结合焓（ΔHobs）中，此时需采用至少两种具有相似pKa但电离焓不同的缓冲液进行测试。
9. 避免使用强酸强碱或高浓度有机溶剂
六、前往筛选平台进行ITC实验需要准备哪些实验用具？
1. 样本（比如母液）
2. 适量缓冲液
实验阶段
一、自动清洗时弹出窗口报错：不能检测到flow
1. 原因分析：连接问题导致洗液循环无法形成。
2. 解决方案：
a) 程序中设置单独清洗样品池与滴定针。
b) 检查各试剂瓶内试剂是否在半满以上，瓶盖是否拧紧；废液瓶可开盖放气后再拧紧。
c) 如果设置了样品池清洗，检查样品池清洗泵是否插入样品池，插入后稍用力向下按可以听到"哒"的锁定声。
d) 检查滴定针橡胶管末端的黑色橡胶头是否完好。
e) 检查橡胶管是否与滴定针正常连接（绿点对绿点），是否完全插入，可重新插拔橡胶管。
f) 检查滴定针下方的固定螺帽是否拧紧。
g) 检查滴定针是否正确插入清洗位，并且被清洗位的卡扣锁定。
h) 都检查完无误后再次清洗，若仍然报错，可联系平台老师。
二、如何设置对照试验？
1. 一般用配体滴定缓冲液作为对照。
2. 对照实验与主实验流程一致。
3. 在保存结果时，如果主实验结果文件命名为Result（可自定义），必须将对照试验的结果文件命名为Result_ctrl。
三、设备旁玻璃微量进样针分加样针和吸取滴定池中废液针，注意区分用途使用。
四、上样时样品池中无法加入280 μL池液？
1. 原因分析：样品池侧壁有气泡。
2. 解决方案：
a) 上样时轻、缓，慢慢把池液注射入样品池。随着液体注入缓慢提升上样针。
b) 可以用上样针在样品池里沿一个方向轻轻搅动。注意搅动程度不能剧烈。
c) 若液面已经有大量气泡无法除尽，吸出池中液体重新上样。
五、什么是理想的热量信号？
1. 正常情况下，水与水滴定的信号值应在0.03 µcal/s左右。
2. 第一个完整滴定峰的总热量（积分热量，非瞬时功率）应大于2.5 μcal。
3. 对于强结合（高C值）实验，因每滴体积较小，第一峰热量应不小1 μcal。
4. 若最强信号值也低于0.1 µcal/s，且对结合有信心，可考虑整体提高浓度再次尝试。
数据分析阶段
一、如何解读ITC得到的热力学参数？
1. 亲和力KD：平衡解离常数，单位为M，KD越小结合越强。
2. 化学计量比n：反映配体与大分子的结合比例，可用于评估样品活性（n值受样本浓度是否精确测量影响）。
3. 焓变ΔH：反映氢键、范德华力等非共价键的变化。
4. 熵变ΔS：反映疏水作用（有利）与构象变化的综合效应。
5. 吉布斯自由能ΔG：决定结合是否自发，ΔG = ΔH – TΔS = RT ln KD。
二、如何合理解释非整数化学计量比（n值）？
获得n ≠ 1可能有多种原因，需谨慎解读：
1. 浓度误差：n值可吸收滴定物或被滴定物的浓度误差。
2. n < 1：可能表示被滴定物活性浓度被高估，或滴定物浓度被低估。
3. n > 1：可能表示被滴定物活性浓度被低估，或滴定物浓度被高估。
4. 真实的化学计量：n可能真实反映了结合位点的数量（如1:2或2:1结合）。
判断方法：改变反应物浓度重复实验。若n值随之系统性变化，则很可能是浓度误差所致；若n值保持不变，则可能反映了真实的化学计量。
三、当结合焓（ΔH）接近零时，ITC是否无效？
不是。生物相互作用的结合焓通常具有很强的温度依赖性（由于热容变化ΔCp）。
解决方案：在不同温度下进行实验。温度的微小改变可能使ΔH变为可测量的正值或负值。
通过测量不同温度下的ΔH，还可以计算出热容变化（ΔCp），这是评估疏水作用贡献的关键指标。
四、如何处理背景热（稀释热）？
背景热是导致错误分析的主要原因，必须妥善处理。
1. 获取方法：
对照实验：将滴定物注入纯缓冲液中。
拟合中包含：在拟合程序中加入一个常数背景项或与浓度相关的背景项。
使用末期数据：对于高亲和力结合，最后几次注射的热效应平均值可视为背景热。
2. 忽视背景热的后果：拟合软件可能会引入虚假的、低亲和力的结合位点来"凑合"数据，导致得出不真实的热力学参数。
五、模型选择与结果不确定性
1.原则：使用能复现数据的最简单模型。
2.模型比较：当两个模型都能拟合时，可使用统计学方法（如F检验或Akaike信息准则）来判断哪个模型更优。
3.结果不确定性：
软件给出的拟合误差仅反映该次拟合的优度，不能代表参数的真正不确定性。
必须通过重复实验（技术重复和生物学重复）来评估参数的可重复性，并计算平均值和标准偏差。
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