• 荧光偏振 Fluorescence Polarization

荧光偏振（Fluorescence Polarization, FP）是一种基于分子旋转扩散的光学检测方法，通过测量荧光发射光的偏振状态变化（各向异性），在均相溶液中实时定量分析分子大小、结合相互作用或微环境粘度。

上世纪60年代，Gregorio Weber设计和制造了第一台实用的荧光偏振仪，并将荧光偏振应用于生物大分子的研究。

图源：Assay Guidance Manual，NIH,2024.

其检测原理可拆解为：

(1) 偏振光激发：

荧光分子的光吸收具有方向性，当激发光为偏振光时，只有吸收跃迁方向与偏振光电场方向平行的分子才能被有效激发。

(2) 激光态寿命与分子旋转

荧光分子被激发后处于激发态，寿命通常在纳秒级，在这短暂期间分子会进行布朗运动（随机旋转）。

(3) 荧光发射的偏振性（核心）

激发态分子弛豫回到基态时，发射的荧光同样有方向性：

如果在激发态寿命（τ）期间，分子发生了显著的随机旋转（分子很小或溶液粘度低，旋转极快），那么其发射跃迁矩的方向完全随机化，此时发射的荧光将是非偏振的（各个方向强度均匀）。

如果在激发态寿命期间，分子没有旋转（分子很大或溶液很粘稠，旋转极慢），那么其发射跃迁矩的方向与激发时的吸收跃迁矩方向基本一致，此时发射的荧光保持高度的偏振性。

 (4) 偏振的检测与量化

检偏器分别测量与激发偏振方向平行（S）和垂直的荧光强度分量（P）。

酶标仪检测的荧光偏振度一般以毫偏值（mP）表示：Polarization (mP)=1000*(S-G*P)/(S+G*P)

G为酶标仪校准值，用于方法优化

还可以用荧光各向异性r值来表示：

r=2*mP/(3000-mP)

Envision酶标仪可以自动计算r值。

• FP检测的优势

优势：

均相检测： 无需洗涤或分离步骤，操作简单；

实时监测： 可进行动力学研究；

灵敏度高： 可检测低浓度结合；

不受荧光强度绝对变化影响： mP/r 是强度比值，对探针浓度、光路波动、淬灭剂等不敏感；

样品消耗少。

关键影响因素：

荧光团的选择： 需要有合适的荧光寿命（通常在几纳秒）、高量子产率、光稳定性好。

标记位点： 标记不应干扰探针与结合伴侣的特异性结合。

分子大小差异： 结合前后分子尺寸变化越大，信号变化越显著（小分子+超大分子效果最佳）。

温度与粘度： 必须严格控制，因为它们直接影响分子旋转速度。

• FP应用于分子互作

FP最强大的应用之一是检测分子间的相互作用（如配体-受体、抗原-抗体、蛋白-蛋白、DNA-蛋白结合等）：

(1) 标记小分子探针： 将一个足够小的荧光团标记（如荧光素、罗丹明和BODIPY）到待研究的分子（如药物小分子、肽段、DNA片段）上。这个小探针分子旋转很快， 因此初始 mP值低。

(2) 加入结合伴侣（大分子）： 当标记的探针分子与其大的结合伴侣（如蛋白质、抗体、DNA）结合时，复合物的流体力学体积显著增大。

(3) 旋转变慢，各向异性增加： 大的复合物旋转非常慢，结合后探针发出的荧光偏振度/各向异性显著升高。

(4) 定量检测： 测量到的 mP/r 值增加直接反映了结合的程度。通过绘制 r值或 Δr 值（必须用r）与结合伴侣浓度的关系图，可以拟合结合常数（Kd）、驻留时间（t_1/2）等参数。

• FP应用于高通量筛选HTS

在荧光偏振（FP）小分子抑制剂高通量筛选中，核心设计是 “竞争性结合” 策略，通过荧光标记的靶标配体（探针）与抑制剂竞争结合靶蛋白，检测探针结合状态改变引起的偏振信号变化（游离探针变多，mP减小）。

(1) 探针设计：

选择高亲和力（如Kd < 100 nM）、小分子量（游离态高旋转自由度）； 

(2) 蛋白与探针浓度优化： 

固定探针浓度，滴定蛋白浓度，绘制结合曲线。

(3) 加样顺序：

可先孵育蛋白-抑制剂一段时间，再加探针孵育。

(4) 竞争抑制：

加入梯度浓度抑制剂，监测mP值下降，计算IC₅₀。

关键优化策略：

(1) 探针亲和力优化，提高信号窗口。

(2) 探针结构优化，降低背景噪声，扣除散射背景。

(3) 验证DMSO对信号影响，通常要求≤1%。

(4) 检测灵敏度优化：Z' >0.5。

(5) 特异性控制：测试非特异性结合，如开发反筛选探针（靶向非竞争口袋）。

• Envision酶标仪检测

（1）筛选平台Envision 2105 (编号：A23000127)  荧光偏振光学配置：

            TRM荧光:   激发：531nm；发射：595s，595p；

            FITC荧光：激发：480nm；发射：535s，535p；

             Cy5荧光：激发：620nm，发射：688s，688p；

             Umbelliferone：激发：355 nm，发射：460s，460p；

您待测物的激发和发射必须在这几个荧光的波长范围内；

（2）Envision配置双检测器，可同时检测s和p方向的发射偏振光；可自动扣除mP值背景；

（3）设置参数：

 - G Factor：G校正因子，在FP设置中比较重要，默认1，一般范围在0.8-1.2之间。调整的原则需要根据结果（mP）进行调整，mP不能有负值；

    - Detector gain/2nd Detector gain: 两个检测器的电压（增压），对应上面的Emission Filter，默认即可，如果检测的结果超出仪器的检测线（结果的颜色会是灰色，一般是＞1.7x107），则降低此数值（最低值不建议低于150）。

    - Number of flashes: 灯闪烁次数，一般20左右即可。

    - Number of flashes per A/D conversion：默认1，不需要更改。

有关FP方法的优化，可联系平台老师。

筛选平台：医学科学楼F017

010-62795723