siRNA文库是利用RNAi技术进行高通量靶点筛选的有力工具。其技术优势在于：

• 识别新的治疗靶点： 在疾病相关表型的筛选中，沉默后能抑制有害表型或增强治疗效果的基因，即为潜在的药物靶点。

• 靶点验证： 对通过其他方法（如生物信息学、表达谱分析）初步筛选出的候选靶点，利用siRNA进行功能验证（敲低后是否产生预期的治疗性表型）。

• 合成致死筛选： 寻找在特定基因突变背景下（如致癌突变），沉默另一个基因会导致细胞死亡的组合，这种组合可作为开发靶向药物的基础。

• 机制研究和生物标志物发现： 研究已知药物靶点的作用机制和耐药机制，并可能发现预测药物反应的生物标志物。

与其它技术的比较优势：

• vs. CRISPR-Cas9敲除：

可逆性： siRNA的瞬时敲低对于必需基因研究至关重要，CRISPR永久敲除会导致必需基因缺失的细胞被淘汰。

筛选速度/成本： 大型siRNA库的合成和筛选通常比构建和维持CRISPR敲除文库更快、更便宜（尤其是在小规模或中等规模筛选时）。

灵活性： 更容易进行剂量或时间依赖性的研究。

• vs. shRNA：

脱靶效应： 经过良好设计和优化的合成siRNA（如siRNA库）通常比基于载体的shRNA脱靶效应更低，因为shRNA需要在细胞内加工成siRNA，过程可能引入更多变异。

瞬时性： siRNA转染是瞬时的，避免了长期表达shRNA可能带来的细胞毒性或选择压力。

应对脱靶效应策略

在siRNA筛选中，脱靶效应（Off Target Effects）是设计和实施筛选的核心关注点。脱靶效应指siRNA在RNA诱导沉默复合体（RISC）作用下，意外下调非目标基因的表达，可能导致假阳性结果或误导性表型。包括序列依赖性脱靶（如siRNA的“种子区域”与非目标mRNA的3' UTR部分互补）和序列非依赖性脱靶（某些siRNA序列或结构可能被细胞内的模式识别受体识别，激活免疫通路，引发基因表达变化）。

减少脱靶效应的策略：

• siRNA混合（Pooling）：将多个针对同一基因的siRNA混合使用（ON-TARGET plus siRNA库即为4混1），可以减少单个siRNA的脱靶效应，同时维持高效的目标基因沉默。

• 化学修饰：对siRNA的特定核苷酸进行化学修饰（如ON-TARGETplus™      siRNA），可减少RISC对非目标mRNA的识别，显著降低脱靶效应（减少高达80%）。

• 生物信息学优化：通过改进siRNA设计，避免种子区域与非目标基因3′-UTR的互补匹配，减少脱靶风险。

平台的ON-TARGETplus™ siRNA文库结合了上述化学修饰、混合策略和生物信息学优化，显著提高了siRNA的特异性和沉默效率。

         其它技术优化还包括：

• 降低siRNA浓度：脱靶效应具有浓度依赖性，但低浓度可能同时降低目标基因的沉默效果。

• 去卷积分析： 分析多个siRNA产生的表型与其预测的脱靶谱之间的相关性，帮助识别更可能是由脱靶效应驱动的假阳性。

• 使用阴性对照： 设计不靶向任何已知基因的siRNA（scrambled siRNA）或靶向无关基因（如荧光蛋白）的siRNA，用于评估非特异性效应和背景噪音。

• 优化转染条件和浓度： 使用能有效敲低目标基因的最低有效浓度，减少饱和效应和非特异性毒性。

• 结合其他技术验证： 用CRISPR-Cas9或shRNA等基于DNA的方法进行独立验证，它们的脱靶机制与siRNA不同，可以交叉确认结果。

siRNA反式转染流程

通常在高通量siRNA筛选中，采用反式转染的策略，即先混合siRNA与转染试剂，后加入细胞。例如以下siRNA反式转染操作流程，适用于384孔板高通量筛选，可供参考：

详细操作步骤：

一、siRNA转移 

 1. siRNA准备： 

   - siRNA终浓度 2.5 μM（文库）或（对照），DEPC水稀释。 

   - 文库siRNA转移体积：100 nL/孔（终浓度10 nM）；

2. 高通量移液： 

   - 将siRNA从源板转移至检测板。 

   - 点样后短暂离心（220×g, 1 min），密封板并储存于-20°C备用。 

二、转染试剂添加 

设备：BioTek EL406（配5 μL 8通道分液管路） 

1. 试剂配制： 

   - 每孔需5 μL混合液：50 nL Lipofectamine RNAi MAX + 4.95 μL Opti-MEM。 

   - 按孔数计算总量，额外增加2 mL补偿死体积。 

2. 仪器清洗（预运行）： 

   - 依次用无菌水→70%乙醇→无菌水→Opti-MEM®冲洗管路。 

3. 点样： 

   - 将混合液加入预点样板，450 rpm震荡15 min（RT），促进复合物形成。 

三、细胞接种 

设备：BioTek EL406（配10 μL 8通道分液管路） 

1. 细胞准备： 

   - 解冻"assay-ready"细胞（或使用对数生长期细胞），完全培养基重悬至 25,000 cells/mL。 

2. 仪器清洗：无菌水→70%乙醇→无菌水→培养基。 

3. 点样： 

   - 每孔加入20 μL细胞悬液（约500 cells/孔）。 

   - 接种后转移至37°C、5% CO₂培养箱，培养72–120 h。 

四、培养监测（可选） 

- 实时成像：使用Incucyte ZOOM活细胞成像系统，无标记监测细胞状态。 

- 毒性检测：培养24 h后，加入CellTox™ Green（终稀释1:2000），荧光法检测死细胞。 

五、终点检测 

选项1：多功能酶标仪 （可选）

1. 活细胞检测（CellTiter-Glo®）： 

   - 每孔加25 μL试剂，震荡5 min，离心去除气泡。 

   - 酶标仪Envision检测超敏化学发光信号（ATP含量∝活细胞数）。 

2. 死细胞检测（CellTox™ Green）： 

   - 酶标仪Envision检测荧光信号（Ex/Em: 485/520 nm）。 

选项2：高内涵成像分析（推荐） 

1. 固定：每孔加25 μL 8% PFA（终浓度4%），室温20 min。 

2. 透化与封闭： 

   - 透化液（0.3% Triton X-100/5%血清/PBS）→封闭液（5%血清/PBS）。 

3. 抗体染色： 

   - 一抗（封闭液稀释）→二抗（含Hoechst核染，PBS稀释），各孵育60 min（避光）。 

4. 成像： 

   - 使用高内涵系统（Opera Phenix），采集4–9视野/孔（10–40×物镜）。

注意事项 ：

孔板layout设计需包含各对照组： 

• 未处理组NT：基线表型、靶基因表达水平、细胞活力参考                             

• 阴性对照siRNA: 排除非特异性效应（如脂质体毒性）

• 阳性对照siRNA: 验证转染效率（如平台课提供靶向GAPDH看家基因）