竞争置换滴定量热法：
等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）通过分子之间在天然条件下滴定过程中的热量变化来表征分子间亲和力，是研究靶点与配体/候选药物相互作用的基本工具之一。在常规ITC实验中，生物分子相互作用的亲和力检测范围通常在毫摩尔至纳摩尔级别（KD：10⁻⁴~10⁻⁹ M）。然而，某些生物分子相互作用的结合常数会显著超出这一范围。例如，对于超强结合反应（KD＜10⁻⁹ M），需要将样品浓度降至极低水平，但这会导致热信号强度低于仪器检测限——除非该相互作用伴随异常大的焓变（如ΔH > 100 kJ/mol）。
针对这种问题，竞争置换滴定量热法（displacement titration calorimetry）提供了一种有效的解决方案。该方法通过预结合较弱亲和力的竞争配体B（如结合常数为10-⁴~10-⁶ M），再通过滴定强结合配体A，实现对强结合配体的竞争性抑制。该方法特别适用于强结合配体（A）与弱结合配体（B）竞争同一结合位点的体系。类似的竞争性置换策略也可用于低亲和力相互作用的测定，从而显著扩展ITC的检测范围——可拓展至10⁻2 M~10-¹² M。
竞争ITC的示意图
ITC实验中的c值：
说到竞争实验，就不得不提ITC实验中的核心参数——c值。c值，也称Wiseman参数，是ITC实验中的一个无量纲参数，在直接滴定实验中，c值定义为：
即滴定池中分子摩尔浓度除以两分子之间的亲和力常数KD。基于c值的样本浓度选择，请参考Q&A ITC常见问题
c值直接反映了ITC结合实验的可检测性：
c值适中（5–500）：信号变化明显，滴定曲线呈S形，拐点清晰，实验数据易于拟合，可同时精确测定KD、ΔH和化学计量比N值；
c值过小（<1）：结合过弱，曲线平坦，信号低于仪器检测限，需用竞争法；
c值过大（>1000）：结合过强，曲线陡峭如垂直线，呈阶跃式变化，难以准确拟合KD，需用竞争法。
不同c值滴定曲线比较，图源Malvern Panalytical Inc.
竞争实验的c值调控：
竞争性置换滴定实验可以调整表观c值：
KD,A：强配体A的亲和力常数；KD,B：弱配体B的亲和力常数；[B]：弱配体B的初始浓度。
竞争实验调控策略：
增加弱配体的浓度[B]，提高分母值，降低capp；
选择中等亲和力的弱配体KD,B（KD,B起码大于KD,A10倍），避免[B]/KB<<1，否则置换效率降低。
ITC竞争实验的操作：
1. 实验设计流程
第一次实验：测定弱配体B的热力学参数
- 操作：直接滴定配体B到蛋白（P）溶液中。
- 目标：获取弱配体B的结合常数（KD,B）、结合焓（ΔHB）和化学计量数（NB）。
第二次实验：竞争置换滴定
- 操作：将蛋白（P）预先与饱和浓度的弱配体B混合（确保结合位点被B占据）；用强配体A滴定该混合溶液，A逐步置换B。
- 目标：通过热信号变化分析强配体A的结合参数（KD,A、ΔHA）。
MicroCal PEAQ-ITC Analysis软件设计竞争实验
2. 上机操作关键步骤
样品准备：
确保蛋白与弱配体B的初始浓度满足：cB=[P]/KD,B（cB需在5-500范围内以提高准确性）。
强配体A的注射浓度（[A]）需足够高，确保滴定过程中能完全置换B。
仪器设置（以MicroCal PEAQ为例）：
注射次数：确保过渡区有足够数据点（至少包含2个点）。
单次注射体积：需优化，避免信号过小或过渡区未被覆盖。
设置恒温条件（通常25°C）。
热稀释空白实验:
单独滴定配体A到缓冲液中，测定稀释热，用于数据拟合时扣除背景信号。
3. 数据分析方法
打开软件MiacoCal PEAQ-ITC Analysis，选择“Competitive Binding”模式，输入已知的KD,B、ΔHB和弱配体的浓度[B]，或者导入弱结合实验数据后，软件自动计算表观亲和力（KD,app）并反推KD,A。
MicroCal PEAQ-ITC Analysis软件分析竞争实验结果
4. 注意事项
参数范围限制：当KD,B>106 KD,A时，过渡区过陡，需减少注射体积或增加注射次数。
若ΔHA≈ΔHB，热信号微弱，需重新设计实验。
实验优化，通过软件模拟调整[P]、[B]和[A]，使表观C值落在5-500范围内。
误差控制：避免弱配体B的浓度过高（[B]/KB<<1），否则置换效率降低。
校准仪器基线，确保热信号信噪比满足要求。
ITC设备编号：18013343
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