选择一个适合的微孔板，往往是高通量筛选或细胞生化检测实验重要的起始步骤之一。可以参照以下流程图，循序渐进考虑和选择最合适我们Assay实验的微孔板。

按照常见的assay方法，分别简述相应孔板的选择：

1. 吸光度检测（Absorbance Assays）

吸光度检测即分析发光反应在特定波长的光吸收量，常见的吸光度检测如ELISA、Bradford、CCK-8等检测。一般建议使用透明的聚苯乙烯（polystyrene，PS）孔板，聚苯乙烯在200-400 nm可见光波段不产生光吸收现象。如果在紫外波段进行光吸收检测，需要使用可透过UV的透明孔板。

如果在检测中出现孔间交叉效应（cross-talk）的干扰，可使用白色透明底孔板替代全透明板。

2. 荧光检测（Fluorescence Assays）

常规荧光检测一般包括荧光强度（fluorescence intensity，FI）、荧光偏振（fluorescence intensity，FP）、荧光能量共振转移（Förster resonance energy transfer assays，FRET）。这类检测常使用FITC、Cy3、Cy5、GFP、ROX、Texas Red、香豆素等低半衰期的荧光标记物，一般建议使用黑色微孔板，以降低反应物中非荧光基团的自发荧光背景。

时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence assay，TRF）通常使用铕（Europium）、钐（Samarium）、铽（Terbium）等镧系元素螯合物或穴状物标记，这类标记物的半衰期长，可在激发和发射之间形成一个延迟期。自发光可在延迟期衰减，对assay的影响微弱。因此，这类检测使用白色或黑色微孔板皆可。

在荧光检测中，如果荧光信号很强，需要考虑孔间cross-talk，可以用黑色孔板替代白色孔板，提高检测的灵敏性。

另外，孔板密度增加时，单孔体积减少，为了提高单孔的荧光信号，更倾向使用白色孔板。例如，96孔板检测使用黑色孔板，384或1536孔板检测使用白色孔板。

3. （化学/生物）发光检测（Luminescence Assays）

发光检测一般包括荧光素酶（luciferase）报告基因检测、luciferase细胞毒性/细胞增殖检测、钙流检测、化学发光的ELISA检测、Alpha检测（amplified luminescent proximity homogeneous assay）和生物发光共振能量转移bioluminescence resonance energy transfer，BRET）检测等。发光检测的信号不局限于特定波长，一般使用白色孔板，以增强发射信号。

在发光检测中，如果信号过强，同样需要考虑cross-talk，可以用黑色孔板替代。

另外，发光检测可能存在非特异性的磷光现象，所以在上机读数前通常会让白板避光10分钟，以减少磷光的背景干扰。

除了白色和黑色孔板之外，有时候也可以选择灰色孔板，既可以保持较高信号水平，又可以降低孔间cross-talk。

4. 高内涵筛选/成像（High Content Screening/Imaging, HCS/HCI）

在选择HCS使用的孔板时，需要考虑孔板的光学特性、是否适合细胞的生长、孔板底部的平整度以及孔板的几何参数是否适配特定的物镜。

Tissue Culture Treatment（TC-treated）处理过的聚苯乙烯板（polystyrene，PS）虽然适合细胞的生长，但孔底的平整度和光学性质都较差。所以，除了384孔和1536孔薄底PS板，不建议使用96孔PS板拍摄高内涵图像。

玻璃底的孔板具有很好的孔底平整度和光学特性，但需要选择经过PDL（多聚赖氨酸）或者胶原（Collagen）包被过的玻璃孔板，以提供适应细胞贴壁生长的环境。

环烯烃（Cyclic olefin，COP）材料的孔板也可以提供良好的平整度和光学特性，且COP孔板通常都经过TC-treated处理，适合细胞生长。

高内涵共聚焦显微镜有两个重要的物镜参数：数值孔径（Numerical Aperture，NA）和物距（Working Distance，WD）。NA可以理解为物镜收集光线的能力和分辨率，NA值大，分辨率高；WD可以理解为聚焦时焦面与物镜前沿的距离。一般NA值高的物镜，相应WD短。所以高内涵实验通常要求孔底厚度（Bottom Thickness，I）＜200 μm。孔底厚度＞250 μm的孔板，只能选择长WD的物镜。孔底距离裙边底的高度（Rim Height，H）＞300 μm也不适合高NA值的物镜和水镜。

对于3D微球或类器官的高内涵成像，建议使用低吸附（low binding）孔板。

除了上述提到的孔板颜色、孔板材料、孔底包被/预处理等方面，孔板几何参数的其它方面也需考虑，如：

孔板通量：96孔、384孔或1536孔，是否有自动化设备支持384或1536孔板。

孔形状：圆孔方便混合，芯吸效应和孔间cross-talk小；方孔可扩大透光性面积，容积较圆孔大，但芯吸效应和孔间cross-talk可能性大。

孔底：平底透光性面积大，适合细胞贴壁，可提供底部读数；V形底可最大程度吸出液体（死体积小）；U形底方便混匀、清洗和包被，也适合悬浮细胞、微球和类器官；C形底既适合光学检测，又适合混匀清洗、悬浮细胞、微球和类器官。

孔体积：工作体积通常为孔最大体积的75-80%。反应体积减少时，可考虑选择低体积（low-volume）的微孔板。

孔间距、板底厚度等几何参数也会影响Cross-talk的程度。

以上描述参考自Revvity公司微孔板选择指南，希望可以帮助大家选择到适合实验的孔板。平台也继续提供适合各类筛选实验的微孔板，欢迎咨询。

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