首先，SPR，BLI，ITC和DSC都是非常重要的相互作用分析的互补技术，所有这些技术都可以获取分子间结合的有无信息（YES Binding）以及结合强弱亲和力（KD）。可靠的结合需要多种技术的交互验证。

SPR和BLI是更为类似的技术，一个基于SPR（表面等离子共振技术），一个基于BLI（生物膜层干涉技术），但都是获取分子间结合和解离快慢，即结合动力学信息。

ITC测定的是分子间因为价键重组所造成吸热或者放热信息，可以给出结合与否，结合强弱，结合比例，和结合的真正热力学信息，当然现在也有第三方软件入Affinimeter使用ITC数据计算结合的动力学信息。ITC还有一个重要应用是做酶学动力学，这一点SPR和BLI做不了的，ITC既可以做酶促反应动力学的Km, Ki, kcat值，也可以测底物和酶的结合亲和力KD。

如果您需要获取结合快慢的信息，建议可以先考虑SPR和BLI，他们都是基于芯片或者tip头的表面结合过程，但由于其中一个ligand需要通过某种方式固定在芯片或者tip头上，需要认真考虑一种使ligand保持活性的方法，这对于成功的实验非常重要，同时由于需要固定在表面附近，ligand的自由度会有所降低，不一定和完全in solution状态一致。但是这两种技术的好处是相对于ITC而言，样品需要量还是要少差不多2-5倍，但需要稀释不同的配体浓度，另外，这两种技术都需要响应的耗材和试剂，相对于样品以外的成本而言要比ITC高一些。这两种技术也可以计算热力学信息，是通过不同温度下的动力学来计算范德霍夫焓变，而不是热力学焓变，这两者还是有区别。

ITC无需耗材，样品状态是in solution，没有对样品的构象有什么影响，可以直接获取真实热力学信息（因为是量热法，焓变直接获取），也不需要固定和再生，但是样品量需要会高一些，实验通量较低，不适合大批量筛选，一般适合对于初步筛选后的候选物进行验证，ITC的假阳性率很低。

对于小分子-蛋白结合或者蛋白-多肽结合的反应，在SPR或者BLI中一般只能获取稳态的亲和力，而无法获取动力学信息时，ITC给出的信息会给完整，比如热力学的全套参数，结合计量比N值在SPR和BLI也很难获取，因为这两种技术中最成熟的方程式按照1:1模式设定的。

但对于结合力比较强的蛋白-蛋白结合，如很强的抗原-抗体结合，如1 nm以下的结合，ITC可能需要用到竞争法来做，SPR和ITC可以比较好的做出，但对于1 nm以上的比如S蛋白和ACE2的结合力，亲和力在15-30 nm级别，ITC做出的数据非常漂亮而且标准。

特别强的亲和力，比如pM级别的，BLI和SPR也都很难做到，因为off rate太慢了，误差非常大，这个时候可以考虑使用微量热DSC来做，DSC可以做到fM-aM级别的结合亲和力，比如biotin和streptavidin之间的亲和力。

DSC主要应用还是用于分析蛋白质高级结构的稳定性，比如生物制药，或者样品高级结构的稳定性比如样品是否容易聚集，是否更容易结晶，从而为分子互作提供质量控制保证。

Malvern Microcal 应用专家